Page 25 - Das Magazin 2019
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 Durch die Entwicklung der CRISPR/Cas9-Gensche- re ist es erleichtert worden, gezielte Änderungen am Erbgut vorzunehmen. Über diese Genschere berichteten wir in Ausgabe 3 (2017). Jetzt stellen wir die Ergebnisse eines eigenen Forschungspro- jekts über erbliche Kavernome vor. Vorläuferzel- len von Gefäßzellen wurden gezielt mit CRISPR/ Cas9 verändert, um anschließend das Wachstums- verhalten der Zellen vergleichend zu beobachten.
Erbliche Kavernome sind Gefäßfehlbildungen im Gehirn und Rückenmark, die sich durch wiederkehrende Kopf- schmerzen, Krampfanfälle und neurologische Ausfaller- scheinungen bemerkbar machen können. Bei Patienten mit erblichen Kavernomen wird in der Regel eine Erbgut- veränderung in einem von drei Genen im Blut gefunden: CCM1, CCM2 oder CCM3 (Cerebral Cavernous Malforma- tion = Zerebrale kavernöse Malformationen).
Auslöser für die Entstehung von Kavernomen scheint eine weitere Erbgutveränderung in der zweiten elter- lichen Genkopie von CCM1, CCM2 oder CCM3 zu sein, die sich im Laufe des Lebens im Rahmen von Zellteilungen in einer Gefäßvorläuferzelle ereignen kann. Dies ist in operativ entfernten Kavernomgeweben nur sehr schwer zu untersuchen, weil Endothelzellen nur einen kleinen Anteil der Zellen im blutigen und oftmals verkalkten Ka- vernomgewebe ausmachen.
Isolation von Patienten-spezifischen Endo- thelzellen
Um der Situation in Kavernomgeweben besonders na- hezukommen, wurde ein Patienten-spezifisches Zellkul- turmodellsystem etabliert, welches die Erforschung der veränderten Prozesse nach einer zweiten Erbgutverände- rung erlaubt. Dazu wurden von einem Patienten mit einer nachgewiesenen Erbgutveränderung im CCM1-Gen 50 ml Blut entnommen. Anschließend wurden zirkulierende Vorläuferstadien der Gefäß-auskleidenden Endothelzel- len isoliert. Diese Methode ist zwar schon seit längerer Zeit bekannt, jedoch komplex und nicht immer erfolg- reich. Zudem ist die Zahl endothelialer Vorläuferzellen in 50 ml Blut mit weniger als 20 Zellen sehr gering.
Gelingt die Isolation, können nach etwa zwei bis vier Wochen unter speziellen Kul- turbedingungen erste Endothelzellkolo- nien beobachtet werden.
Modellierung der Kavernomentstehung in der Zellkultur
Unter Verwendung der CRISPR/Cas9-Genschere ist es uns anschließend gelungen, in den aus Blut gewon- nenen Gefäßzellen des Patienten mit einer von einem Elternteil ererbten CCM1-Variante gezielt die zweite CCM1-Genkopie zu verändern. Somit entstanden neben der ursprünglich isolierten Endothelzelllinie weitere Linien, in denen beide CCM1-Genkopien derart verän- dert waren, dass in diesen Zellen kein funktionsfähiges CCM1-Protein (Eiweiß) mehr gebildet wird. Damit hatten wir in Patienten-spezifischen Zellkulturen die 1971 erst- mals von Knudson beschriebene Zweischritt-Inaktivie- rung nachgestellt.
Zusätzlich gelang es in einem weiteren experimentellen Ansatz, mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Genschere die Patien- ten-spezifische Erbgutveränderung zu korrigieren. Diese Zellen enthielten folglich zwei normale CCM1-Genko- pien, die voll funktionsfähiges CCM1-Protein bilden. Es zeigte sich, dass Zellkolonien mit einer kompletten Inak- tivierung von CCM1 ein schnelles Wachstum aufwiesen, während Zellen mit korrigierter CCM1-Anlage nicht wei- ter kultiviert werden konnten.
Um dieser Beobachtung auf den Grund zu gehen, wur- de zu einem Zellgemisch aus korrigierten Zellen (Abb. 1, grün) und normalen Zellen des Patienten (Abb. 1, grau), die eine intakte und eine veränderte Anlage aufweisen, Zellen gegeben, in denen CCM1 komplett ausgeschaltet worden war (Abb. 1, rot). Dieses Zellgemisch wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen gezüchtet.
Oktober 2019
  Die CRISPR/Cas9-Genschere in der Erforschung erblicher Kavernome
Dr. rer. nat. Stefanie Spiegler, Dr. med. Matthias Rath, Christiane D. Much & Prof. Dr. med. Ute Felbor
   Abbildung 1: Zellen mit komplettem CCM1-Verlust (rot) über- wachsen korrigierte (grün) und unveränderte (grau) Zellen bereits nach 16 Tagen und dominieren fortan das Zellgemisch. CCM1-/-: Zellen mit zwei ausgeschalteten CCM1-Genkopien, CCM1+/+: korrigierte Zellen,
CCM1+/-: unveränderte Zellen des Patienten mit einer ererbten CCM1-Variante (modifiziert nach Spiegler et al. 2019).
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